تستهای سرولوژی رایج در طیور (قسمت دوم )

روش  تهیه گلبول قرمز مرغ (RBC) شسته شده:             

مواد و وسایل مورد نیاز

۱ – سرم فیزیولوژی ۰٫۸۵ در صد

۲ –  خون کامل مرغ

۳ – سیترات سدیم چهاردرصد استریل (چهار گرم پودر سیترات سدیم در ۱۰۰ سی سی آب مقطر )

۴ – دستگاه سانتریفوژ

۵ –  پیپت پاستور

۶ –  لوله آزمایش

ابتدا خون اخذ شده از مرغ (پرنده ای که واکسن بیماریهای مورد آزمایش را دریافت نکرده باشد) به نسبت حجمی۱ به ۵ با سیترات سدیم ۴درصد ترکیب شده تا منعقد نگردد (ترجیحا خون داخل سرنگ حاوی سیترات ۴ درصد از پرنده اخذ شود و همانجا به آرامی مخلوط شود وسپس داخل لوله آزمایش ریخته شود ) پس از آن لوله حاوی خون مذکور به دستگاه سانتریفوژ منتقل شده که در آن  به مدت ۱۰ دقیقه با دور ۱۵۰۰،  سانتریفوژ می گردد و پس از اتمام آن، سرم جدا شده تخلیه می گردد و هم حجم آن سرم فیزیولوژی  استریل  افزوده می شود و مجدداً این کار ۳ الی ۴ بار تکرار می شود و در نهایت ۱ میلی لیتر از گلبولهای قرمز شسته شده به این شیوه به ۹۹ میلی لیتر سرم فیزیولوژی استریل  افزوده می گردد تا محلول ۱% آن تهیه شود و در آزمایش مربوطه به کار رود.

روش تهیه محلول فسفات بافر سالین  (PBS) در جدول زیر توضیح داده شده است .

نحوه انجام آزمايش HA (Heamagglutination):

آنتی ژن های استفاده شده در آزمایشHI معمولا بدلایل مختلفی ممکن است قدرت آگلوتیناسیون خودرا ازدست داده و بعبارتی ضعیف شوند که این امر قدرت آنها در آگلوتیناسیون را ضعیف و در نتایج آزمایش باعث ایجاد جوابهای مثبت کاذب یا تیترهای بالای کاذب می گردد  .لذا از آزمایش هماگلوتیناسیون یا (HA) به منظور ارزیابی کمی آنتی ژنهای بدست آمده از کشت سلولی و یا تخم مرغهای جنین دار  و نیز به منظور سنجش عیار آنتی ژن مورد استفاده در آزمایش HI  قبل از انجام آن،  استفاده می گردد .

مواد و وسایل  مورد نیاز در آزمایش HA :

۱ – میکرو پلیت ۹۶ خانه با کفU شکل

۲ – سرم فیزیولوژی۰٫۸۵ در صد یا محلولPBS

۳ –  آنتی ژن

۴ –  گلبولقرمزشستهشدهمرغیاگونهموردآزمایش

۵ – سمپلر یک و چند کاناله ۲۵ میکرولیتری

۶ – شیکرمکانیکی

۷ –  انکو باتور ۲۵ درجه سانتیگراد

۸ -دستگاه سانتریفوژ

مراحل آزمایش:

۱ –  افزودن۲۵ میکرو لیتر سرم فیزیولوژی یا PBS در تمامی گوده های یک ردیف

۲ – افزودن ۲۵ میکرولیتر آنتی ژن رقیق شده طبق توصیه سازنده به گوده اول و رقت سازی آن تا آخرین گوده نظیر تصویر۳

۳ – افزودن ۲۵ میکرو لیتر گلبول قرمز مرغ شده ۱ درصد به تمام گوده ها

۴ –  قرار دادن میکروپلت روی شیکر مکانیکی به مدت ۱۵ ثانیه

۵ – قرار دادن میکروپلت به مدت ۳۰ دقیقه در دمای ۲۵ درجه

۶ – بررسی نتایج:  log2 رقت آخرین گوده ای که گلبول قرمز در آن آگلوتینه شده است(گلبولها ته نشین نشده اند)، تیتر HA آنتی ژن مورد استفاده می باشد. .

نحوه محاسبه تعداد واحد HA مورد نیاز آنتی ژنهای نیوکاسل و آنفلوانزا برای استفاده در آزمایش HI:

به منظور تهیه ۴ واحد آنتیين ND و ۸ واحد آنتی ژن AI، از آخرین گودهای که در آنآگلونیتاسیون صورت گرفته است،تعداد ۲ گودهدر ND و ۴ گودهدر AI به عقب برگشته و رقت گوده مورد نظر همان میزان رقیق ساز یویال اصلی آنتی ژن برای تهیه واحدهای مورد نیاز است. به عنوان مثال اگر نتیجه HA یک ویال آنتی ژن در حجم مورد آزمایش ۲۵ میکرولیتر، ۱:۵۱۲ باشد،در صورت نیاز به تهیه ۴ واحد آنتی ژن ND،از رقت فوق به تعداد چهارگوده به عقب برگشته که میشود ۱:۱۲۸ ،به عبارت دیگر باید یک میلی لیتر از محلول ویال با ۱۲۷ میلی لیتر PBS مخلوط میشود تا در نهایت آنتیژن رقیق شده فوق دارای ۴ واحد HA آنتیژن ND باشد. روش محاسبه دیگرآن که تیتر بدست آمده HA،در ND تقسیم بر ۴ و در AI،تقسیم بر ۸ میشود تا میزان رقیق سازی به دست بیاید. به عنوان مثال،درصورت بدست آمدن تیتر HA 1:512 در ND،  ۵۱۲ تقسیم بر ۴ میشود که برابر است با ۱۲۸٫

تصویر۳: مراحل انجام آزمایش HA

آزمایش تیتراسیون معکوس (Back  Titration)  :

این آزمایش که در حقیقت نوعی آزمایش HA می باشد، به منظور ارزیابی آنتی ژن رقیق شده قبل از انجام هر بار آزمایش HI و با هدف اطمینان از وجود تعداد واحد مورد نیاز (۴ واحد در ND و ۸ واحد در AI)در هر ۲۵ میکرولیتر از آنتی ژن مذکور انجام می شود.

مواد و وسایل مورد نیاز :

۱ –  میکرو پلیت

۲ – سمپلر

۳ – گلبول قرمز شسته شده

۴ – سرم فیزیولوژی

۵ –  شیکر مکانیکی

۶ – انکوباتور  ۲۵ درجه سانتیگراد

مراحل انجام این آزمایش کاملاً مشابه آزمایشHA می باشد ولی با این تفاوت که در مرحله افزودن آنتی ژن، از آنتی ژن رقیق شده (به عنوان مثال آنتی ژن دارای ۴ واحد در ND و یا ۸ واحد در AI) استفاده می شود و در مرحله مشاهده نتایج باید در صورت صحیح بودن رقت ساری آنتی ژنها، در ارزیابی آنتی ژن ND، باید گلبولها در گوده سوم(۴ واحد) و در AI، باید در گوده چهارم (۸ واحد) آگلوتینه نشده و در ته آن تجمع یابند

مراحل  انجام آزمایش تیتراسیون معکوس در ارزیابی آنتی ژن رقیق  شده در  تست HI

تفسیر تست تیتراسیون معکوس :

در آنتی ژن  نیوکاسل ۴ واحدی، در گوده اول ۴ واحد، گوده دوم ۲ واحد و گوده سوم، باید صفر ( عدم آگلویناسیون به علت عدم وجود آنتی ژن) باشد و در خصوص آنتی ژن آنفلوانزا ۸ واحدی نیز در گوده اول ۸ واحد، گوده دوم ۴ واحد، گوده سوم ۲ واحد و در گوده چهارم باید صفر باشد

برای خواندن ادامه مقاله اینجا کلیک کنید.

برای بازدید از سایت دام پخش اینحا کلیک کنید.