استفاده از آزمایشات سرمی و بررسی عملکرد و سطح آنتی بادیها در سرم طیور از روشهای رایج در بیشتر آزمایشگاههای دنیا و کشورمان می باشد که از آن جمله می توان به آزمایش HI یا آزمایش ممانعت از آگلوتیناسیون وآزمایش الایزا اشاره نمود که عمدتا بدلایل ارزانتر بودن و سهولت در اجرا نسبت به سایر آزمایشات بیشتر طرفدار داشته ودر آزمایشگاه ها بیشتر انجام می گیرند.بعلاوه نتایج بدست آمده از آنها نیز در صورتیکه بادقت و با بررسی شرایط گله های مورد آزمایش مورد توجه و تفسیر قرار گیرند آزمایشات بسیار کاربردی در صنعت طیور بوده و در بسیاری از موارد بیماری قابل اجرا می باشند و در تشخیص بیماری و رهگیری سطح آنتی بادی بر علیه بیمار ها و همچنین تعیین حدودی مدت زمان درگیری گله و ویا حدت احتمالی بیماری بسیار کاربردی می باشند . اساس این آزمایشات سرمی ذکر شده (HI ,الایزا ) بر اساس شناسایی وسنجش کمی و کیفی آنتی بادیها ی ایجاد شده بر علیه یک عامل عفونت زای مشخص مانند: ویروسها ، باکتریها ،قارچها ویا حتی انگلها می باشد
در این مقاله سعی کرده ایم تا مطالب عنوان شده انشالله راهگشای همکاران دامپزشک ، مسولین فنی آزمایشگاههای دامپزشکی و دانشجویان عزیز و علاقه مند رشته های مختلف دامپزشکی بوده و دوستان و علاقمندانی که در این زمینه قصد مطالعه و فراگیری آزمایشات سرمی روتین در صنعت طیور را دارند بتوانند با مطالعه این مقاله ابهامات و یا اشکالات احتمالی خود در انجام این آزمایشات را برطرف نمایند .
۱- آزمایش ممانعت از هماگلوتیناسیون (HI)
کاربرد آزمایش HI در طیور عمدتا در راستای ارزیابی سطح سرمی سیستم ایمنی هومورال در طیورمی باشد به گونه ای که میران پاسخ سیستم ایمنی بدن پرنده به برخی از عوامل عفونت زا را که قادر به آگلوتینه کردن گلبولهای قرمز پرنده هستند مورد ارزیابی قرار می دهد . یکی از عمده ترین کاربردهای این آزمایش، محاسبه سطح آنتی بادی برعلیه ویروسهای آنفلوانزا و نیو کاسل در طیور بر اساس log2 رقتهای مورد آزمایش می باشد.
وسایل و مواد لازم جهت آزمایش HI
۱ – میکرو پلیت ۹۶ خانه با کفU شکل
۲- سرم فیزیولوژی۰٫۸۵ در صد یا محلولPBS
۳- آنتی ژن نیوکاسل یا آنفلوانزا ی تیتر شده به وسیله آزمایش HA و به میزان ۴ واحد در بیماری نیوکاسل و۸ واحد در بیماری آنفلوانزا
۵ – گلبول قرمز شسته شده مرغ (RBC)
۶ -سمپلر یک کاناله و ۸ کاناله ۲۵ میکرولیتری
۷- شیکر یا هم زن مکانیکی
۸- انکوباتور ۲۵ درجهسانتیگراد
۹- سانتریفوژ
قبل از توضیح مراحل آزمایش ذکر یک نکته بسیار ضروری بنظر میرسد و چون از تجربیات آزمایشگاهی نگارنده مقاله می باشد انشاالله برای کاربران مفید می باشد .چند نکته بسیار مهم در طول مراحل مختلف آزمایش وجود دارد که رعایت آنها به دقیق بودن آزمایش بسیار کمک می نماید :
۱- بعداز پایان مراحل آزمایش کلیه پلیت های آزمایش را ابتدا با آب سرد شسته و سپس در آب مقطر داغ ۵۵ در جه بمدت ۱۰ دقیقه قرار دهید سپس در آب مقطر خنک شستشو نمایید اینکار از ماندن لکه های خون و یا رسوب املاح آب در کف پلیت ها جلوگیری می نماید .
۲- کلیه لوله های آزمایش مخصوص نمونه سرم ، سر سمپلرها ، لوله های مخصوص ساخت RBC ،و سرم فیزیولوژی حتما توسط اتوکلاو استریل شده باشند .
۳ – حداقل هر ۲روز یکبارقدرت آنتی ژن ارزیابی شود (تیتر HA) و همچنین سمپلرها هر ۶ ماه یکبار کالیبره شوند .
۴- محلول سیترات بکار رفته در تهیه RBC هر سه روز یکبار به تازگی تهیه شده و یا محلول موجود مجددا با اتوکلاو استریل گردد .
۵- دمای محیط بسیار بر روی زمان مراحل مختلف آزمایش تاثیر گذار بوده و سرد بودن بیش از اندازه و یا گرمای زیاد محیط باعث تسرسع یا کند شدن مراحل مختلف آزمایش بخصوص در مرحله پایانی و پس از افزودن RBC می گردد لذا حتما دمای محیط را تنظیم و آزمایش در دمای ۲۷- ۲۳ درجه سانتیگراد انجام شود
۶- شیک کردن پلیت و تکان دادن آن در زمان افزودن سرم ، آنتی ژن و یا RBC جزو کلیدهای اساسی آزمایش HIبوده و بایستی بادقت و حرکت ملایم و حداکثر یک دقیقه انجام گردد .
۷ – قبل از هر بار آزمایش حتما گلبول قرمز شسته شده خود را از بابت سلامت و تشکیل دگمه استاندارد کنترل کنید و فقط به تست کنترل آزمایش بسنده نکنید .
مراحل انجام آزمایش:
۱ – افزودن۲۵ میکرو لیتر سرم فیزیولوژی یا PBS در تمامی گوده های یک ردیف
۲ – افزودن ۲۵ میکرولیتر سرم مشکوک پرنده در گوده اول و رقت سازی آن تا آخرین گوده نظیر تصویر ۲
۳ – افزودن ۲۵ میکرولیتر آنتی ژن تهیه شده به تمامی گوده ها
۴ – قرار دادن میکروپلت روی شیکر مکانیکی به مدت ۱ دقیقه البته در صورت موجود نبودن شیکر با حرکت ملایم پلیت به چپ وراست از سمت طولی پلیت اینکار انجام گردد .
۵ – قرار دادن میکروپلت به مدت ۳۰ دقیقه در دمای ۲۵ درجه سانتی گراد
۶ – افزودن ۲۵ میکرو لیتر گلبول قرمز مرغ شسته شده ۱ درصد به تمام گوده ها
۷ – قرار دادن میکروپلت روی شیکر مکانیکی به مدت ۱۵ ثانیه
۸ – قرار دادن میکروپلت به مدت ۳۰ دقیقه در دمای ۲۵ درجه
۹ – بررسی نتایج: log2 رقت آخرین گوده ای که گلبول قرمز در آن آگلوتینه نشده است، تیتر HI سرم مشکوک می باشد.
نکات مهم در هنگام بررسی نتایج تست HI
۱ – توصیه می گردد پس از ارزیابی اولیه آنتی ژنها به وسیله آزمایش HA و تهیه رقت مناسب، قبل از انجام هر بار آزمایش HI، به منظور اطمینان از صحت آنتی ژنها، آزمایش تیتراسیون معکوس در این خصوص انجام گیرد.
۲ – با توجه به لزوم اعتبار سنجی (Validation) آزمایش مذکور در آزمایشگاه، باید از نمونه سرم مثبت با تیتر مشخص و نمونه سرمی منفی (مانند نمونه های اخذ شده از جوجه های SPF) در انتهای هر ردیف استفاده شود تا صحت آزمایش انجام شده ارزیابی گردد.
۴ – به منظور اطمینان از جوابهای بدست آمده و جلوگیری از ایجاد نتایج کاذب، باید بررسی نتایج در اسرع وقت صورت گیرد.
۵ – به منظور بررسی نتایج در گوده ها، توصیه می شود میکروپلت به صورت ملایم حرکت داده شود که در این حالت در گوده هایی که هماگلوتیناسیون انجام نشده (رقتهای HI مثبت) گلبولهای قرمز رسوب شده در ته گوده ها بصورت قطره اشک حرکت می کنند.
۶ – توصیه می گردد در صورت انجام آزمایش HI برای ارزیابی پاسخ سرمی طیور مختلف مانند بوقلمون و شتر مرغ، از گلبول قرمز همان پرندگان بطور اختصاصی استفاده شود
تصویر شماره ۱: مراحل انجام آزمایش HI.
تصویر ۲: نمونه ای از یک میکروپلت پس از اتمام مراحل آزمایش
HI: در این میکروپلت
برای خواندن ادامه مقاله اینجا کلیک کنید.
برای بازدید از سایت دام پخش اینحا کلیک کنید.
