آزمایشات سرولوزی رایج در طیور
آزمایش الایزا (ENZYME LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY= ELISA)
مواد و ابزار مورد نیاز الیزا(روش غیر مستقیم)
۱ – کیت تجاری
۲ – سرم
هر کیت شامل موارد ذیل است:
۱ – میکرو پلیتهایی از جنس پلاستیک پلی وینیل و ۹۶ خانه که ظرفیت هر حفره ۳۵۰ میکرولیتر است و توسط آنتی ژن مورد نظر پو شانیده شده است.
۲ – کنترل منفی (Negative control)
۳ – کنترل مثبت (Positive control)
۴- بافر حلال (Diluent Buffer)
۵ – کانژوگه که شامل آنتی ایمونوگلوبولین G متصل به آنزیم پر اکسیداز نشاندار شده می باشد
۶ – محلول سوبسترا (Substrate) که در اکثر کیتهای تجاری حاوی Tetramethylbenzideneو Oxidant preservative می باشد.
۷ – محلول متوقف کننده (Stop Solution) که حاوی هیدرو فلوریک اسید ۰٫۱۲% می باشد و باعث توقف واکنش می شود.
قبل از انجام آزمایش الایزا، باید تمامی بخشهای کیت تجاری مورد استفاده، به منظور هم دمایی در خارج از یخچال قرار گیرند. در همین حین می توان چیدمان گوده های مورد استفاده در آزمایش در نرم آفزار مشخص گردد تا در حین اجرا این کار، سبب اتلاف وقت و کاهش تمرکز در انجام سایر مراحل نگردد.
مراحل انجام آزمایش
بطور کلی پروتکل اجرایی آزمایش ELISA ممکن است بسته به دستورالعمل شرکت سازنده، در هر کیت متفاوت باشد ولی اساس کلی اجرای مراحل این آزمایش به قرار زیر است:
۱ – افزودن ۱۰۰ میکرولیتراز سرم کنترل منفی را در خانه شماره ۱ ردیفA و۱۰۰ میکرولیتردر خانه شماره ۱ ردیفB
۲ – افزودن ۱۰۰ میکرولیتراز سرم کنترل مثبت در خانه شماره ۱ ردیفC و۱۰۰ میکرولیتردر خانه شماره ۱ ردیفD
۳ – افزودن ۱۰۰ میکرولیتراز سرم رقیق شده مشکوک (رقت سازی باید طبق دستورالعمل کیت مورد استفاده صورت گیرد. در برخی از این کیتها، باید نمونه سرمی به میزان ۱:۵۰۰ رقیق شود.)
۴ – قرار دادن میکروپلتها به مدت ۳۰ دقیقه در دمای اتاق (بسته به توصیه سازنده)
۵ – تخلیه و شستشوی میکروپلت با استفاده از آب مقطر دیونیزه با محلول شستشوی موجود در کیت به میزان ۲ الی ۳ بار
۶ – افزودن ۱۰۰میکرولیتر محلول کونژوگه به تمامی گوده های مورد آزمایش که در حقیقت همان آنتی ایمونوگلوبولین Ig G متصل به پر اکسیداز نشاندار بوده که به آنتی بادی متصل به آنتی ژن می پیوندد.
۷ – قراردادن میکروپلت به مدت ۳۰ دقیقه در دمای ۲۵ درجه سانتی گراد بسته به توصیه شرکت سازنده.
۸ – تخلیه و شستشوی میکروپلت با استفاده از آب مقطر دیونیزه با محلول شستشوی موجود در کیت به میزان ۲ الی ۳ بار
۹ – افزودن ۱۰۰ میکرولیتر محلول سوبسترا به تمامی گوده های مورد آزمایش که در حقیقت در این مرحله سوبسترای آنزیم با آنزیم مربوطه ترکیب شده و ایجاد رنگ می نماید.
۱۰ – قراردادن میکروپلت به مدت ۱۵دقیقه در دمای ۲۵ درجه سانتی گراد بسته به توصیه شرکت سازنده.
۱۱ – .افزودن ۱۰۰ میکرولیتر محلول متوقف کننده واکنش (Stop Solution) به تمامی گوده های مورد آزمایش
۱۲ – قرار دادن میکروپلت در دستگاه Elisa Reader (اغلب در طول موج۶۵۰ (۶۹۰-۶۲۰ ) نانومتر سنجیده می شوند)
۱۲ – اودی های بدست آمده از دستگاه الایزا ریدر با استفاده ازنرم افزار اختصاصی شرکت سازنده، بصورت تیتر محاسبه و ارزیابی می گردند.
تفسیر نتایج آزمایش الایزا
میانگین تیترهای بدست آمده، مؤلفه اصلی در تفسیر نتایج می باشد که به دو صورت حسابی (AMT) و هندسی (GMT) محاسبه می گردد. تفسیر سطوح مختلف تیترها نیز بسته به نوع کیت تجاری مورد استفاده، متفاوت بوده و بدین منظور باید از راهنمای تفسیر نتایج شرکت سازنده کیت استفاده گردد. یکی دیگر از فاکتورهای مورد استفاده در تفسیر نتایج آزمایش الایزا، میزان پراکندگی تیتر های بدست آمده می باشد که در حقیقت بیانگر میزان یکنواختی آنها بوده و به وسیله محاسبه درصد پراکندگی یا CV بدست می آید.
در صورتیکه پراکندگی تیترها (CV%) در حد مطلوب باشد، می توان از میانگین حسابی (AMT) به عنوان شاخص اصلی وضعیت تیترها استفاده نمود ولی در مواردی که درصد پراکندگی بالا و نا مناسب باشد، میانگین هندسی(GMT) قابل اطمینان تر است.
تفسیر درصد CV:
کمتر از۴۰ % خوب
۴۱% الی ۷۰% متوسط
بیشتر از ۷۱% ضعیف.
برای بازدید از سایت دام پخش اینجا کلیک کنید.
